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簡要描述:Minerva Super Fusion Cloning Kit(無縫克隆試劑盒) 產(chǎn)品貨號: M2026L 產(chǎn)品規(guī)格:10 μL× 50T 儲(chǔ)存條件:-20℃保存,有效期見外包裝。
產(chǎn)品型號: M2026L
所屬分類:分子生物學(xué)
更新時(shí)間:2024-05-23
Minerva Super Fusion Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)
產(chǎn)品貨號: M2026L
產(chǎn)品規(guī)格:10 μL× 50T
儲(chǔ)存條件:-20℃保存,有效期見外包裝。
產(chǎn)品介紹:無縫克隆是一種簡單、快速并且高效的 DNA 定向克隆技術(shù),可將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。 Minerva Super Fusion Cloning Mix 通過識別 DNA 片段和線 性化載體末端的 15-25 bp 同源序列,50℃反應(yīng) 15-60 min 即可將 DNA 片段和線性化載體高效精確地融合在一起, 完成定向克隆,且克隆陽性率可達(dá) 95%以上。
產(chǎn)品特點(diǎn):
1. 簡單、快速、高效,可將插入片段克隆至任意線性載體 的任意位點(diǎn);
2. 不依賴于連接酶,無載體自連,陽性率可達(dá) 95%以上;
3. 無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點(diǎn);
4. 一次反應(yīng)可完成單至多個(gè)片段重組。
使用方法:
一. 制備線性化克隆載體
選擇合適的克隆位點(diǎn),對載體進(jìn)行線性化,線性化載體 可以通過酶切或者反向 PCR 擴(kuò)增完成。
(1)酶切制備 雙酶切:線性化,轉(zhuǎn)化背景(假陽性克?。┑?; 單酶切:線性化程度差,可通過適當(dāng)延長酶切時(shí)間來減 少環(huán)狀質(zhì)粒的殘留。 注:(1)雙酶切無需去磷酸化,單酶切需要去磷酸化; (2)酶切完成后,應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重 組反應(yīng)。 (2)反向 PCR 擴(kuò)增制備 載體質(zhì)粒 DNA 為模板,克隆位點(diǎn)為分界點(diǎn),設(shè)計(jì)一對 反向引物,推薦使用高保真 PCR Mix 進(jìn)行擴(kuò)增。
二. 設(shè)計(jì)插入 PCR 引物片段 PCR 引物的 5’端必須包含與其相鄰片段(插入片段或 載體)末端同源的 15~25 nt(推薦 18 nt)序列。假如載體 為粘性末端,且 3’端突出,則引物設(shè)計(jì)必須包含突出部分; 若 5’端突出,則引物設(shè)計(jì)可以包含突出部分,也可以不包含。 插入片段擴(kuò)增引物: 5’—上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)(可選)+基因特 異性正向擴(kuò)增序列—3’ 3’—基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點(diǎn)(可選)+下游 載體末端同源序列—5’
注:盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆,當(dāng)載體克隆 位點(diǎn)上下游 25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為 40~60%時(shí),重組高
三. 插入片段的 PCR 擴(kuò)增 插入片段可用任意 PCR 酶 (Taq 酶或高保真酶) 擴(kuò)增, 無需考慮產(chǎn)物末端有無 A 尾 (重組過程中將被去除, 在最 終質(zhì)粒中不會(huì)出現(xiàn))。 建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增以減 少擴(kuò)增突變的發(fā)生。建議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行無縫 克隆反應(yīng),若 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴(kuò) 增產(chǎn)物,可直接可用于無縫克隆反應(yīng),但加樣的體積不宜超 過反應(yīng)總體積的 20% 。
四.無縫克隆反應(yīng):
1. 冰水浴中配制以下反應(yīng)體系:1.最適載體用量(ng)= 0.02×載體堿基對數(shù),即 0.03 pmol。 2 插入單片段時(shí),最適片段用量(ng)= 0.04×片段堿基對數(shù);插入多 片段時(shí),每片段量(ng)= 0.02×片段堿基對數(shù)。 注:(1)如果插入的單片段長度大于載體,那么應(yīng)互換載體與插入片段 用量; (2)如果插入的片段長度小于 200 bp,那么要使用 5 倍載體的用量; (3)如果按上述公式計(jì)算得到的用量低于低/高于最高值,那么建議 直接按低/最高用量使用; (4)載體或插入片段過長,片段數(shù)量過多,均會(huì)降低陽性率。 體系配制完成后,輕輕吹吸數(shù)次混勻各組分,避免產(chǎn)生 氣泡即可,切勿渦旋。
2. 將反應(yīng)體系置于 50℃,反應(yīng) 15-60 min。 注:(1)推薦使用溫控比較精準(zhǔn)的儀器進(jìn)行反應(yīng),如 PCR 儀,反應(yīng)時(shí) 間不足或過長都會(huì)降低克隆效率; (2)當(dāng)載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上時(shí),建議延長反 應(yīng)時(shí)間到 30~60 min; (3)50℃反應(yīng)完成后,建議進(jìn)行瞬時(shí)離心,將反應(yīng)液收集至管底。 3. 將反應(yīng)液離心管置于冰水浴中冷卻,直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化或儲(chǔ) 存于-20℃。 注:-20℃儲(chǔ)存的重組產(chǎn)物,建議在 1 周內(nèi)使用。
五. 克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 在 100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中加入 5-10 μL 反應(yīng)液,輕柔吹 吸混勻,置于冰上 30 min。42℃熱激 45~60s,冰浴 5 min。 加入 500 μL SOC 或 LB 培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng) 40-60 min (200 rpm)。將菌液均勻涂布在含相應(yīng)抗生素的平板上,倒 置于 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。 注:(1)不同感受態(tài)細(xì)胞最后的克隆陽性率會(huì)有所差別,推 薦使用轉(zhuǎn)化效率>108 cfu/μg 的感受態(tài)細(xì)胞; (2)PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度決定了菌落數(shù); (3)陽性對照平板通常生長大量白色單菌落,陰性對照平 板只生長很少的菌落。
六. 陽性克隆檢測菌落 PCR 鑒定:挑取單菌落置于 10 μL ddH2O 中混勻, 95℃裂解 10 min,取 1 μL 作模板,進(jìn)行菌落 PCR 鑒定,推薦使用 UE 2×Taq PCR Master Mix(Green)(S2045)。 酶切鑒定:將單菌落接種到抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,提 取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
注意:(1)建議菌落 PCR 時(shí),至少使用一條通用引物,可有效避免假 陽性結(jié)果; (2)必要時(shí)可進(jìn)一步對陽性結(jié)果進(jìn)行測序鑒定